İnsan pluripotent kök hüceyrələrindən (hPSC) alınan kortikal organoidlər güclü modellərdir, lakin tez-tez aşağı səmərəlilik, dəyişiklik və streslə əlaqəli əşyalar ilə məhdudlaşır. Bu çətinliklərə cavab vermək üçün, istehsal və tək hüceyrəli RNA sekvensiyasını (scRNA-seq) əhatə edən son-son keyfiyyət nəzarəti (QC) ölçülərini ehtiva edən miqyaslı bir organoid platforması hazırladıq. 96-cı kəsici cüt formatı istifadə edərək 64 xəttdə 100% organoid formalaşmasına nail olduq. Nəzarət edilən buraxılış FGF2 hPSC pluripotensiyasını artırır və mesendodermal çirkləndiriciləri azaldır, SB431542 dozu optimallaşdırılır, dəyişən TGFBR1/ ALK5 ifadəsi ilə xətələr üzrə kortikal nümunələri artırır. Nəticədə yaranmış organoidlərdə transkriptomik profil və insan kortexinin inkişafına yaxın uyğun aşağı stres imzaları göstərilirdi. Kortika organoid scRNA-seq indeksini (CortiCOSI) tətbiq edərək, tau hiperfosforilyasiyasından və oligomerizasiyasından əvvəl MAPT V337M həyəcanlı nevronda fosfataz tənzimləyicilərinin (PPP2CA, ANP32A) və prefoldin alt hissəsi PFDN6 erkən disrequlyasiyasını müəyyən etdik. Bu platforma kortikal organoid tədqiqatlarında miqyaslılıq, reproduktivlik və mexaniki anlayışı yaxşılaşdırır.
hPSC-dən alınan beyin organoidləri beyin qoruğuna doğru nümunə götürülür və bu, qoruğunun toxumasında in vivo meydana gələn 3D çox hüceyrəli qarşılıqlı təsirləri əhatə edən dəyərli modellərdir1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Kortika inkişafı zamanı, ventrikulyar radial gliya, xarici radial gliya və orta progenitor hüceyrələri daxil olmaqla, sinirli ata hüceyrələri əvvəlcə dərin təbəqə və sonra yuxarı təbəqə kortika həyəcan neuronları, inhibitor nevronları, astrocitlər və oligodendrokitlər istehsal edir. hPSC-dən alınan kortika organoidləri in vivo hüceyrə istehsalının bu inkişaf ardıcıllığını yenidən toplayır4,11,12,13,14,15,16,17. Nəticədə yaranmış organoidlər uzunmüddətli mədəniyyətə malikdirlər və kortikal inkişafı və xəstəliklərin inkişafı haqqında vaxtlı tədqiqatlar aparılmasına imkan verir16,18,19,20,21.
hPSC-dən alınan kortika organoidləri müxtəlif nevroloji və psixiatriya xəstəliklərini, o cümlədən nevrodevəltmə və nevrodegenerativ xəstəlikləri modelləşdirə bilər20,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Məsələn, biz və başqaları kortika organoidlərindən istifadə edərək, dominant irsi frontotemporal demensiya (FTD) əsasında olan patoloji prosesləri öyrənmişik. FTD davranış, biliş, dil və hərəkət pozğunluqlarının klinik spektrini əhatə edir. MAPT mutasiyaları olan şəxslərdə əsas neyropatologiya tau patologiyası ilə frontotemporal lobular dejenerasiya ilə xarakterizə olunur (FTLD-tau)18,19,30,31,32,33,34. MAPT genində 50-dən çox xəstəliklərə səbəb olan mutasiya müəyyənləşdirilib35,36,37.
Biz əvvəlcə MAPT V337M mutasiyası ilə bağlı dəyişikliklərin vaxt keçidini xarakterizə etmişik18. 2 aylıq organoidlərdə aşkarlanan erkən dəyişikliklər arasında RNA- bağlayan proteinin ELAVL4 - in dəyişmiş ifadəsi, alternativ birləşmələrin pozulması, erkən inkişaf, glutamaterji yolların pozulması və dəyişmiş proteostaz18 daxildir. Sonrakı mərhələdəki organoidlərdə qeyri-normal olaraq fosforlaşmış tau və seçkin glutamaterji kortikal nevron ölümü müşahidə edilmişdir, əsasən altı ayda baş vermişdir18. Beləliklə, kortikal organoidlər FTLD-tau patogenesisinin əsas temporal xüsusiyyətlərini yenidən toplaya bilər və yeni genlərin və yolların müəyyənləşdirilməsini təmin edə bilər. Bu, FTLD-yə bağlı patofizioloji fenotipləri müəyyən etmək üçün Tau Konsorsium kolleksiyasından əlavə MAPT mutasiya xəttlərinə analizimizi genişləndirməyə səbəb oldu. Bununla birlikdə, bir çox donordan böyük xətti dəstlərdə kortikali organoid modelləşdirilməsi çoxlu organoid dəyişikliyi və yüksək stres imzaları ilə mane olur, bu da təkrarlana bilənliyi və effektiv xəstəlik modelləşdirilməsini məhdudlaşdırır4,19,39,40,41,42,43,44. Bu çətinliklər həm donorlar arasında, həm də donorlar daxilində hPSC xəttləri arasında özəl fərqləri əks etdirir42,45,46, belə ki, vahid protokolların tətbiqi heterogen organoid nəticələrə səbəb olur13,42. Bu dəyişiklik səs-küyə səbəb olur və genotiplərə əsaslanan fenotipləri gizlədirir və qıtlıq ölçülə bilən QC metrikləri ilə xətələrdə yaxşı nümunəli, aşağı stresli kortikal organoidləri istehsal edən protokollara kritik ehtiyac yaradır. Bu ehtiyac xüsusilə nadir mutasiyalara malik olan xəstələrdən alınan kolleksiyalarda, əlavə xəttlərin yaradılması imkanlarının məhdud olduğu FTLD-tau-ları idarə edənlərdə kəskindir.
Burada istehsal və scRNA-sekuziyanı əhatə edən end-to-end QC ölçülərini müəyyənləşdirən 17 xətti istifadə edərək hazırlanmış, o cümlədən 7 MAPT mutasiya donorundan ibarət miqyaslı kortikal organoid protokolunu bildiririk. Bu platformanı istifadə edərək yaradılan yaxşı nümunəvi organoidlər kortikal xüsusi transkriptomik imzalar, ardıcıl nümunə və əhəmiyyətli dərəcədə az sayılan hüceyrə təzyiqi imzaları nümayiş etdirir. Bu xüsusiyyətlər, alternativ metodlarla yaradılan məlumat dəstlərinə də tətbiq olunan scRNA-seq nümunələrində yaxşı nümunə alınmış kortikal organoidləri müəyyənləşdirmək üçün bir kompost metrik olan CortiCOSI-nin inkişafına imkan verdi. Biz geniş fenotip məlumatları olan əvvəlki V337M scRNA-seq məlumat dəstimizə CortiCOSI tətbiq etdik və uyğun, yaxşı nümunəvi profillərlə izogenik cütləri müəyyən etdik. CortiCOSI- ni seçən bu alt dəstənin transkriptomik təhlili bütün məlumat dəstində aşkar edilə bilməyən erkən molekulyar imzaları ortaya qoydu, bu da daha sonra tau hiperfosforilyasiyasının və oligomerik tau yığmasının təmsilçiləri kimi 2 ayda PP2A vasitəsilə defosforilyasiyanın azaldılmasını və prefoldin kompleks funksiyasının azaldılmasını göstərdi. Bu tapıntılar, erkən transkriptom dəyişiklikləri müəyyən etmək və bir çox MAPT mutasiya xəttində mexaniki tədqiqatlar və gələcək təhlillər üçün idarə edilə bilən bir sistem qurmaq üçün ardıcıl, QC-yə yönəlmiş insan organoid modelləşməsinin gücünü göstərir.
MAPT mutasiya xəttləri ilə izogenik nəzarətlər arasında fenotip müqayisələrin mümkün olması üçün hPSC-dən alınan kortikal organoidlərin böyük miqyaslı partiyaları istehsal etməyə çalışdıq. Əvvəlcə şəkilində təsvir edilmiş hPSC organoid protokolundan istifadə etdik. 1A. Bu metodda tez-tez organoidlər birləşdirilir və bu da əl ilə
Xülasə — davamını mənbədə oxuyun.
