Yerli uzun oxuma texnologiyası getdikcə daha çox yaygındır, lakin ümumiyyətlə tək hüceyrə həlli yoxdur. Bu, məkan dəyişkən isoformların bir hüceyrə tipli daxilində dəyişikliyi və ya bölgəyə aid hüceyrə tipli tərkibdəki fərqləri əks etdirdiyini cavablandırmır. Burada Spl-ISO-Seq2 (500-nm çözünürlük) və ona müşayiət edən proqram, Spl-IsoQuant-2 və Spl-IsoFind hazırladıq. Bunu böyük siçan beyninə tətbiq edərək, biz məlum bölgələr arasında fərqlənən isoform bolluğu və əvvəlcədən müəyyən edilmiş bölgələrdən asılı olmayan məkanlı isoform nümunələri müqayisə etdik. Hər ikisi bir-biri ilə üst-üstə düşən zərbələr müəyyənləşdirdi, məsələn, oligodendrocitlərdə Rps24. Tanınmış Snap25 məkanlı isoform dəyişikliyi üçün, biz onu stimullaşdırıcı nöronlarda meydana gətirdiyini göstəririk. Bölgədəgnostik yanaşma, həmçinin, məsələn, İghm üçün bölgə əsaslı müqayisələrdə qaçırılan nümunələri aşkar etdi. Qeyd edək ki, çox sayda məkanlı isoform siqnalları yalnız hüceyrə tipli tərkibinə görə idarə edilmir. Nəhayət, proqramımız bir çox məkan və tək hüceyrə protokollarına tətbiq olunur və platformalar arasında yenidən qurulma qabiliyyətini göstərir (məsələn, Visium HD/Stereo-seq). Ümumiyyətlə, təcrübə və analitik metodlarımız submikron həllində isofom görünüşü və məkanlı isofom xəstəliklərin araşdırılması üçün yollar açır.
Yerli isoform biologiyasında əsas sual hüceyrənin yerli mövqeyinin onun isoform ifadəsinə təsir edib-etməməsidir. Bu sual beynindəki fərqli bölgələrə hakim olan müxtəlif hüceyrə növləri ilə qarışdırıla bilər. Buna görə də, məkanlı olaraq paylanmış isoformların hüceyrə tipli mənşəli olanlardan ayırılması üçün tək hüceyrə həllində məkanlı isoform məlumatları vacibdir.
Bir hüceyrə və bir nüvə uzun oxunuşlı sıralama ayrı hüceyrə növlərində isoformların profilyələşdirilməsinə imkan yaradır1,2,3,4,5. Qısa oxunuşlı sıralama əsaslı yanaşmalar həmçinin hüceyrə növü xüsusi splic junctions6,7,8, müəyyən hüceyrə növlərində istifadə edilən və ya təkamül və/və ya xəstəliklərdə dəyişdirilmiş eksonları aşkar edir5,9,10; lakin bu metodların əsas çatışmazlığı hüceyrələrin məkan yerləşməsinin itirilməsidir, bu da izofomların hüceyrə növü xüsusi səviyyədə məkan tənzimlənməsinin tədqiqatını mane edir.
Eyni zamanda, məkanlı gen ifadəsi profilyantlaşdırılması hüceyrə növlərini və toxuma hissələrində gen ifadəsi yerləşdirərək sahəni irəli sürdü11,12,13,14,15,16,17,18. 10x Genomics Visium texnologiyasına əsasən biz və həmkarlarımız eyni zamanda məkanlı isoform sekvensiyasını hazırladıq və beyin quruluşları ilə sıx əlaqəli bir çox isoform keçidini və bir bölgədə isoform dəyişikliklərini göstərən digər isoformları (məsələn, Snap25) ortaya qoyduq.4,19; Bununla birlikdə, Visiums 55-μm məkan ölçüsü, siçan beynindəki orta hüceyrə diametrindən çoxdur və beləliklə çox hüceyrə nümayiş etdirən çoxsaylı hüceyrə növlərini əks etdirən pseudo-bulk ölçülərini ortaya çıxardıq.
Slide-SeqV2-ni uyğunlaşdırmaqla (re. 12), daha sonra 10 μm çözünürlüklü məkanlı isoform sekvensiyası (Spl-ISO-Seq) və müvafiq proqram Spl-IsoQuant20 inkişaf etdirdik. Spl-ISO-Seq, cDNA-ların qarışıq və (hələ) tam olması üçün eksom sekvensiyalaşdırma sondası5 və uzun molekul seçimi20 istifadə edir. İnsan beynindəki böyük hüceyrələri, həyəcan neuronları kimi müəyyənləşdirmək üçün 10 μm-lik bir həll kifayət etsə də, daha kiçik hüceyrələri müəyyənləşdirmək üçün xüsusi bir həll yoxdur. Bu, xüsusilə siçanlar kimi digər ümumi modellər orqanizmlərini nəzərə alsaq problemlidir.
O vaxtdan bəri, daha yüksək qətnaməni dəstəkləyən məkan transkriptomiki texnologiyaları, o cümlədən Visium HD 3 məkan assay21 və Stereo-seq22 buraxıldı. Stereo-seq, Visium HD ilə müqayisədə daha yüksək qətnamə təklif edir (500 nm vs 2 μm), bu da onu tək hüceyrəli uzun oxunma məkan transkriptomikasına yaxşı uyğunlaşdırır. Yalnız nüvələrin etiketləndiyi ssDNA rənglənməsindən segmentləşmə və ~ 10 μm z nümunə götürülməsindən sonra da ikiqatlara səbəb ola bilsə də, həllin əhəmiyyətli artımı fərdi hüceyrələri məkanlı şəkildə öyrənmək üçün perspektivlidir.
Xülasə — davamını mənbədə oxuyun.
